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L'ossido nitrico regola la via dei polioli del metabolismo del glucosio nelle cellule muscolari lisce vascolari KOTA V. RAMANA. DEEPAK CHANDRA. SANJAY SRIVASTAVA. Aruni BHATNAGAR e SATISH K. SRIVASTAVA. 1 Dipartimento di Human Biological Chemistry e Genetica, Università del Texas Medical Branch, Galveston, Texas, Stati Uniti d'America e la Divisione di Cardiologia, Dipartimento di Medicina, Università di Louisville, Louisville, Kentucky, Stati Uniti d'America Corrispondenza: 1 Corrispondenza: Dipartimento di Umana Chimica e Genetica Biologica camera 6,644, Basic Science Building, Università del Texas Medical Branch a Galveston, TX 77.555-0647, Stati Uniti d'America. E-mail: utmb. edu astratta ssrivast riduzione del glucosio Maggiore attraverso la via dei polioli enzima aldose reduttasi (AR) è stato collegato allo sviluppo delle complicanze diabetiche secondarie. Poiché AR è una proteina redox-sensibile, che in vitro è facilmente modificato da donatori di NO, abbiamo testato l'ipotesi che NO può essere un regolatore fisiologico di AR. Abbiamo scoperto che la somministrazione della NO sintetasi (NOS) inibitore NG - nitro - l - arginina estere metilico (L-NAME) è aumentato accumulo di sorbitolo nell'aorta di ratti non diabetici e diabetici, mentre il trattamento con l - arginina (un precursore di NO) o patch di nitroglicerina impedito l'accumulo di sorbitolo. Quando incubate ex vivo con alti livelli di glucosio, l'accumulo di sorbitolo è stato aumentato di L-NAME e prevenuta con l - arginina in strisce di aorta da ratti o wild-type, ma non eNOS-deficienti, topi. L'esposizione a donatori di NO anche inibito accumulo sorbitolo AR e ha impedito in cellule di ratto aortica muscolari lisce vascolari (VSMC) in coltura. I donatori di NO è aumentato anche l'incorporazione di radioattività nella proteina AR immunoprecipitato da VSMC in cui la piscina è stata glutatione prelabeled con 35 S-cisteina. Sulla base di queste osservazioni, vi suggeriamo di NO regola la sintesi vascolare di polioli di S-thiolating AR Pertanto, aumentando NO sintesi o biodisponibilità possono essere utili per prevenire i cambiamenti diabete indotte nel pathway. Ramana poliolo, KV Chandra, D. Srivastava, S. Bhatnagar, A. Srivastava, l'ossido nitrico SK regola la via dei polioli del metabolismo del glucosio nelle cellule muscolari lisce vascolari. diabete mellito è caratterizzata dal metabolismo glucidico, che di solito è associata a livelli elevati di glucosio nel sangue (1 2 3). Anche se a causa di carenza di insulina o la resistenza, l'utilizzazione del glucosio è diminuita nei tessuti che richiedono insulina per l'assorbimento del glucosio, tessuti in cui il trasporto del glucosio non è regolamentata dalla faccia di insulina grave e sostenuta iperglicemia (4. 5). Poiché utilizzazione glicolitico è saturo, eccessiva glucosio in questi tessuti viene convertito sorbitolo tramite riduzione NADPH-dipendente catalizzata da reduttasi (AR). In normali condizioni euglicemico, sintesi sorbitolo rappresenta un minore (3) destino di glucosio nei tessuti non renali, tuttavia, a livelli incontrati durante diabete, da 30 a 35 del glucosio potrebbe essere convertito al sorbitolo. Questo aumento del via dei polioli è stata collegata a diversi cambiamenti patologici nei tessuti insulino-sensibili, come quelli nei vasi sanguigni, nervi periferici, midollare renale, cellule del sangue, e la lente oculare. Sebbene i meccanismi per cui l'aumento della via dei polioli contribuisce al danno iperglicemico non sono ben compresi, è stato suggerito che il osmotica e / o stress ossidativo imposto da accumulo sorbitolo e deplezione NADPH può essere significativi cambiamenti biochimici che contribuiscono ai cambiamenti patologici osservati (6. 7). Tale componente di lesione iperglicemici è dovuto all'aumento dell'attività poliolo percorso è supportato da numerose evidenze che dimostrano che l'inibizione di AR impedisce diabetica nefropatia, neuropatia, e catarattogenesi nei ratti (8. 9). Il contributo di AR al danno iperglicemici è ulteriormente supportata dall'osservazione che sovraespressione specifica lente di AR accelera cataratta diabete nei topi (10). Tuttavia, l'utilità clinica degli inibitori AR nel trattamento di complicanze diabetiche secondarie rimane poco chiaro. Anche se alcuni dei risultati clinici variabili possono essere correlati al dosaggio inadeguato e ipersensibilità di individui selezionati, la limitata efficacia a lungo termine di questi farmaci può essere dovuto in parte alle modifiche post-traslazionali in AR che alterano legame ligando e catalisi. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che Ar isolato nei tessuti diabetici visualizzata alterati proprietà cinetiche ed era relativamente insensibile a idantoina inibitori quali sorbinil rispetto all'enzima da tessuti normali (11). Simili cambiamenti nelle proprietà cinetiche e ligando di AR sono stati ottenuti in vitro sulla modifica tiolo dell'enzima da perossido di idrogeno (H 2 O 2) o NO, indicando che l'attività intracellulare di AR può essere regolata da reazioni redox-sensibili. L'elevata sensibilità della AR a ossidanti quali H 2 O 2 e NO è dovuto ad una cisteina reattiva (Cys-298) presente nel sito attivo dell'enzima (12). Abbiamo dimostrato che Cys-298 è facilmente modificato da donatori di NO e che a seconda delle condizioni della reazione e la natura del donatore di NO utilizzata, l'enzima è o S-tiolati o S-nitrosi (13. 14). Sulla base di queste osservazioni, abbiamo ipotizzato che nessuna regola l'attività intracellulare di AR e di conseguenza il flusso di glucosio attraverso la via dei polioli. Per verificare questa ipotesi, abbiamo esaminato se i cambiamenti nella sintesi di NO o biodisponibilità influiscono sull'attività AR o sintesi di sorbitolo in aorta da animali diabetici o non diabetici. I nostri risultati mostrano che NO inattiva AR e inibisce la sintesi di sorbitolo e che questo può riguardare reversibili S-thiolation di AR. MATERIALI E METODI Materiali S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), NONOate dietilammina (NONOate), S-nitrosoglutathione mono-etil-estere (GSNO-estere), 2- (4-carbossifenil) -4,4,5,5 - tetramethylimidazoline-1-oxyl-3oxide (carbossi-PTIO), l - arginina, e NG - nitro - l - arginina estere metilico (L-NAME) sono stati acquistati da Calbiochem (San Diego, CA, USA). S-nitrosoglutathione (GSNO), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), NADPH, d, l - glyceraldehyde, d, l - dithiothreitol (DTT), cicloesimide e cocktail inibitore della proteasi (AEBSF, leupeptina, nestatin, E-64, pepstatina - A) sono stati ottenuti da Sigma (St. Louis, MO, USA). Sorbinil e tolrestat sono stati ottenuti in dono da Pfizer (Groton, CA, USA) e Ayerst (New York, NY, USA), rispettivamente. Deriva-Sil è stato acquistato da Regis Technologies (Morton Grove, IL, USA. Anticorpi policlonali contro ricombinante AR sono state sollevate nei conigli. 35 SL-cisteina è stato ottenuto da New England Nuclear (Boston, MA, USA). Dulbeccos modificato Eagles media (DMEM ), tampone fosfato (PBS), penicillina / soluzione di streptomicina, tripsina, e siero fetale bovino (FBS) sono stati acquistati da Invitrogen (San Diego, CA, USA). Reagenti per dodecil solfato di sodio PAGE (SDS-PAGE) e transblotting sono stati ottenuti da Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico. in vivo regolazione della via dei polioli in condizioni normali e diabetici aorta di ratto per studiare gli effetti in vivo di NO, il diabete è stata indotta in 3 mesi - OLD ratti Sprague-Dawley iniettando streptozotocina (STZ 65 mg / kg di peso corporeo). Solo i ratti che avevano livelli di glucosio nel sangue in gruppi patch di nitroglicerina IV e VIII che rilasciano NO 200 ng / min (calcolata sulla base di manuale produttori, Schwarz Pharma) sono stati applicati alla regione del collo dorsali preshaved e sostituiti ogni giorno. Dopo 10 giorni di trattamento, i ratti sono stati uccisi e le loro aorte sono stati rimossi. L'aorta è stata omogeneizzata in 1 ml di PBS contenente 20 L di cocktail di inibitori delle proteasi. attività di AR e contenuti sorbitolo delle omogenati sono stati misurati. I dati sono presentati come media SD e valori di P sono stati determinati da studenti spaiati t test utilizzando Microsoft Excel 2000. Regolamento di attività AR e l'accumulo di sorbitolo in aorta ex vivo dell'aorta addominale è stato dissezionato da ratti Sprague-Dawley, C57 / BL-6 topi , oppure i eNOS topi nulli nei precedenti C57 / BL6 (ottenuto da Jackson Laboratories, West Grove, PA, USA). L'aorta è stato sezionato in sei strisce 5 mm. strisce aortiche da 6 a 8 animali sono stati raggruppati e suddivisi in gruppi di 6 pezzi a caso in ciascun gruppo. Le strisce aortici sono state incubate in mezzo M-199 contenente 10 FBS, 1 penicillina / streptomicina, e 2 g / mL cycloheximide in assenza o in presenza di 2 mM L - arginina o 1 mM L-NAME alle 37C in un umidificata CO 2 incubatore . Dopo 12 h di incubazione, 50 mM di glucosio è stato aggiunto al mezzo e l'incubazione è continuata per altre 24 ore. I campioni sono stati lavati con PBS ghiacciato e omogeneizzati in 1 ml di 0,1 M di fosfato (pH 7,4) contenente proteasi inibitore cocktail attività AR e il contenuto sorbitolo sono stati misurati (15. 16). Colture cellulari e trattamento Lo VSMC sono state mantenute e coltivate a confluenza in DMEM supplementato con 10 FBS e 1 penicillina / streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5 CO 2. Prima aggiunta dei donatori di NO, il terreno è stato sostituito con tampone Krebs-Hansliet (KH) contenente (in mM): NaCl, KCl 118, 4.7 MgCl 2. 1,25 CaCl 2. 3.0 KH 2 PO 4. 1.25 EDTA, 0,5 NaHCO 3. 25 glucosio 5, pH 7,4. soluzioni dei donatori di ossido nitrico (SNAP, SIN-1, GSNO, GSNO-estere, NOC-9, o NONOate) o inibitori AR (sorbinil e tolrestat) ad una concentrazione finale di 1 mM sono stati aggiunti al mezzo di coltura fresco preparata. In alcuni esperimenti, SNAP stato aggiunto al VSMC coltivate in presenza di DMEM con 10 FBS. I campioni sono stati incubati a 37 ° C sotto 5 CO 2 per 2 ore, poi 40 mM glucosio è stato aggiunto al mezzo di incubazione e l'incubazione è proseguita un ulteriore 4 h. Per la rigenerazione di attività AR, la VSMC sono state incubate con donatori di NO per 2 h, seguito da sostituzione del supporto con mezzi freschi senza donatori di NO l'incubazione è stata proseguita per altri 6 h. Le cellule sono state raccolte e lisate in 10 mM fosfato (pH 7,0) contenente 20 L di cocktail di inibitori delle proteasi. Un'aliquota del campione è stato rimosso per determinare il contenuto proteico totale, e l'attività enzimatica AR e il resto del campione è stata utilizzata per misurare sorbitolo. Misurazione di AR e sorbitolo tessuti o cellule sono state omogeneizzate in 1 ml di 0,1 M di fosfato (pH 7,4) contenente cocktail di inibitori delle proteasi. L'attività è stata misurata usando AR gliceraldeide come substrato come descritto in precedenza (15. 16). Per misure sorbitolo, proteine nel omogenato (0,5 mL) sono stati rimossi per precipitazione con Ba (OH) 2 e ZnSO4 (0,5 M ciascuno). I 10.000 g surnatanti sono stati ultrafiltrazione utilizzando Amicon YM-10 MicroCon e liofilizzato. I campioni liofilizzati sono stati essiccati durante la notte in un essiccatore sotto vuoto ad CaCl 2 e derivatizzati aggiungendo 0,1 mL di Deriva-Sil. Un microlitro del campione derivatizzato è stato applicato ad un Varian 3400 gascromatografo accoppiato ad un rivelatore a ionizzazione di fiamma di idrogeno. Gli zuccheri sono stati separati su una colonna capillare Chrompack imballato con CP Sil 24CB. La temperatura della colonna è stata fissata a 140C e programmato per aumentare ad una velocità di 4C / min a 170C, poi a 250C ad una velocità di 50C / min. La temperatura viene quindi mantenuta costante per altri 3 minuti. La porta di iniezione viene mantenuta a 250C e temperatura del rivelatore è stato fissato a 300C. La quantità di sorbitolo nel campione è stata calcolata utilizzando derivatizzati reagente sorbitolo e trattati mediante un protocollo identico. marcatura metabolica di VSMC e immunoprecipitazione di AR è stata rimossa Il mezzo dal pallone contenente confluenti VSMC e le cellule sono state lavate con il tampone KH. Le cellule sono state poi reincubate con il tampone KH contenente 2 g / mL di cicloesimide (per inibire la sintesi proteica) a 37 ° C in 5 CO 2. Dopo 60 min di incubazione, 20 mol / mL L - 35 S-cisteina è stata aggiunta al pallone e le cellule sono state incubate un ulteriore 5 h etichettare piscina glutatione. Le cellule metabolicamente marcate sono state incubate con SNAP per le durate indicate. Per immunoprecipitare AR, le cellule sono state lisate con fredda tampone Tris-Triton (1 Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM Na 2 O 2 V 7. 0.2 mM PMSF , 0,5 NP-40, e 20 L di cocktail di inibitori delle proteasi) e centrifugato a 10.000 g per 5 minuti a 4C. Un'aliquota del surnatante è stato utilizzato per misurare la concentrazione proteica. A 500 g di proteine totali lisato, 2 volumi di tampone di immunoprecipitazione (2 Triton X-100, 300 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,4 mM Na 2 O 2 V 7. 0.4 mM PMSF , sono stati aggiunti 1.0 NP-40, e 20 L di cocktail di inibitori delle proteasi) e 50 g di anticorpi purificati per affinità AR ed i campioni sono stati incubati a 4 ° C per 2 h. Dopo l'incubazione, è stato aggiunto 100 L di perline proteina-A agarosio ei campioni sono stati incubati durante la notte su un agitatore a 4C per precipitare libera e legata IgG. I campioni sono stati centrifugati a 10.000 g per 5 minuti e lavate due volte con tampone di immunoprecipitazione. Il pellet è stato risospeso in 50 L di 250 mM Tris pH 6,8 contenente 4 SDS, mescolati, e centrifugato a 10.000 g per 5 min. Il surnatante è stato utilizzato per SDS-PAGE usando gel 10. Il gel è stato quindi essiccato e autoradiografato. RISULTATI regolamento della via dei polioli da NO in ratti normali e diabetici Nella prima serie di esperimenti, abbiamo esaminato se NO regola la via dei polioli in situ. Abbiamo studiato entrambi i ratti diabetici e non diabetici, in cui sintesi di NO è stato stimolato o inibita. Abbiamo testato la possibilità che esogeni NO consegna da macchie di nitroglicerina potrebbe influenzare l'accumulo di polioli. Nel controllo, i ratti non diabetici, il contenuto sorbitolo dell'aorta dorsale è stato minimo (3,5 nmol / mg di proteina). Tuttavia, questo era notevolmente superiore nell'aorta di ratti diabetici (Tabella 1). La drammatica differenza di 22 volte nel contenuto sorbitolo dell'aorta diabetici e non diabetici è stata correlata con un 20 volte maggiore attività AR negli omogenati di aorta di ratti diabetici vs ratti non diabetici. Questi risultati dimostrano che il diabete è associato ad una marcata up-regolazione della via dei polioli, che potrebbe essere rappresentato da un parallelo aumento dell'attività AR, e che i cambiamenti diabetici in testa via ad un accumulo netto di sorbitolo in nave parete. Regolazione dell'attività AR e l'accumulo di sorbitolo da NO nell'aorta di ratto non diabetici e diabetici a Per esaminare se NO colpisce l'attività vascolare della via dei polioli, non diabetici e diabetici ratti sono stati trattati con l - arginina, un substrato di ossido nitrico sintasi (NOS) che, al momento della consegna per via sistemica, aumenta la produzione di NO. Come mostrato nella Tabella 1. le t ratti - arginina trattati accumulati 25 rispetto sorbitolo nell'aorta rispetto agli animali non trattati. Gli effetti inibitori sono stati più pronunciati nei ratti diabetici: il contenuto sorbitolo dell'aorta era 80 inferiore rispetto agli animali non trattati. La diminuzione accumulo sorbitolo nell'aorta diabetici e non diabetici dopo trattamento l - arginina stata accompagnata da una corrispondente inibizione dell'attività AR. L'applicazione delle patch di nitroglicerina ha provocato anche in diminuzione dei livelli di sorbitolo e di attività AR in aorta diabetici e non diabetici. Tuttavia, i livelli di sorbitolo e attività AR diminuiti meno drammatico di quello osservato con l - arginina (Tabella 1). Collettivamente, queste osservazioni indicano che NO inibisce AR e l'accumulo poliolo nell'aorta di ratti diabetici e non diabetici. Per verificare il caso inverso, cioè l'inibizione della sintesi di NO promuove l'accumulo di sorbitolo, abbiamo esaminato gli effetti dell'inibitore NOS L-NAME. Come mostrato nella Tabella 1. trattamento con L-NAME ha portato ad un aumento di 1,7 volte in accumulo sorbitolo nei ratti non diabetici e un aumento di 3 volte in ratti diabetici. Queste modifiche sono state accompagnate da un aumento proporzionale all'attività AR (Tabella 1). suggerendo che l'inibizione NO sintesi aumenta l'accumulo di sorbitolo e di attività AR. regolazione acuta di AR da nessun cambiamento nell'attività croniche AR e l'accumulo di sorbitolo in aorta di animali non diabetici e diabetici sono suscettibili di essere a causa di molteplici processi e influenze normativi. Quindi, per valutare se NO potrebbe influenzare l'attività acutamente AR, abbiamo esaminato il ruolo di NO nella regolazione accumulo sorbitolo in ex vivo preparazioni di dell'aorta. Ex vivo cambiamenti nella via dei polioli è improbabile che siano modulati da cambiamenti NO-indotte a ormoni e citochine, che potrebbero influenzare la via dei polioli. Per ridurre al minimo l'influenza di confusione di NO sull'espressione della proteina, il mezzo di incubazione è stata integrata con cicloesimide per inibire la sintesi proteica. In queste condizioni, l'incubazione delle strisce aortici con 50 mM di glucosio determinato significativo accumulo di sorbitolo (Fig. 1). L'accumulo di sorbitolo nelle strisce aortico di topi eNOS-deficienti era, tuttavia, significativamente maggiore di quelli preparati dal wild-type (/ BL6 C57) mice, indicando che la mancanza di eNOS promuove l'accumulo di sorbitolo. Aggiunta di L - arginina al mezzo completamente abolita l'accumulo sorbitolo e l'attività AR inibito nelle strisce aortici preparate da ratti Sprague-Dawley non diabetici o topi C57 / BL6. Tuttavia, l - arginina non ha inibito né un'attività AR o accumulo sorbitolo nelle strisce aortici di eNOS NULL topi (Fig. 1). indicando che gli effetti inibitori del l - arginina sono interamente dovuta alla sua capacità di stimolare la sintesi di NO con eNOS e che non influenza direttamente l'attività AR o formazione di sorbitolo. Analogamente, l'inibizione della NOS da L-NAME ha portato ad un aumento significativo dell'attività AR e l'accumulo sorbitolo nelle strisce aortici preparate da ratti Sprague-Dawley o topi C57 / BL6. Tuttavia, L-NAME ha avuto effetti significativi su entrambi l'attività AR o l'accumulo di sorbitolo in strisce aorta preparati da eNOS topi nulli. Insieme, questi dati suggeriscono che la capacità di L-NAME e l - arginina di modulare l'attività vascolare della via dei polioli è interamente dovuta loro effetti sulla eNOS e che NO generato dalla endotelio è un modulatore chiave della sintesi poliolo. Questi dati forniscono ulteriori prove a sostegno delle osservazioni fatte in situ che maggiori NO lead generation ad un aumento dell'attività AR e accumulo sorbitolo, mentre l'inibizione della sintesi di NO ha l'effetto opposto. Inoltre, poiché gli effetti in vivo ex stati osservati in assenza di sintesi proteica, suggeriscono la possibilità che la modificazione post-traduzionale di AR può essere un meccanismo significativo che NO regola la via dei polioli. Regolamento di attività reduttasi e contenuti sorbitolo in aorta da NO. Le aorte addominale di ratti Sprague-Dawley, topi C57 / BL6 e topi eNOS-null in background C57 / BL6 stati sezionati in anelli e incubati con 2 mM L - arginina o 1 mM L-NAME per 12 h, quindi è stato aggiunto glucosio ad una concentrazione finale di 50 mM. Dopo 24 h, i pezzi di aorta sono stati omogeneizzati e la loro attività AR e il contenuto sorbitolo misurati. Le barre di errore rappresentano SD del media per 3 esperimenti separati. P 0,01 e non significativa rispetto ai topi C57 / BL6. Effetto di donatori di NO su VSMC per sondare il meccanismo post-traslazionale per cui NO regola AR, abbiamo usato VSMC colta in cui i livelli di NO possono essere controllati facilmente in una popolazione di cellule omogenea senza l'uso di inibitori della NOS o attivatori. Per questi esperimenti, il confluenti VSMC sono state incubate in tampone KH con diverse concentrazioni di SNAP da 0,25 a 2,0 mm per 2 ore, dopo di che sono state raccolte le cellule, lisati ed utilizzati per misurare sorbitolo e AR. Incubazione con SNAP ha portato ad una riduzione dose-dipendente in attività di AR (dati non riportati). L'incubazione con 1 mM SNAP ha portato ad un progressivo declino della attività enzimatica, e massima (80) inibizione è stata osservata dopo 2 ore di incubazione con 1 mM SNAP (Fig. 2). Quando il mezzo SNAP-contenenti è stato rimosso e le cellule sono state reincubate in terreno SNAP-libera, un progressivo aumento dell'attività AR è stata osservata e 85 l'attività è stata ripristinata, indicando che l'inibizione di AR da SNAP era facilmente reversibile. inattivazione reversibile di reduttasi da NO. Il VSMC sono state incubate in tampone KH contenente 1 mM SNAP per 02 ore, quindi l'attività AR è stata determinata. Per esaminare la rigenerazione di attività AR, le cellule sono state lavate con tampone KH e reincubate in mezzi freschi senza SNAP per 4-12 h. attività di AR in VSMC è stato determinato ai diversi periodi di tempo. Per evitare legami non specifici di NO al siero proteine, gli esperimenti con SNAP sono stati condotti in media KH privo di siero. Tuttavia, la rimozione di siero potrebbe influenzare negativamente la redditività di VSMC o avviare eventi di segnalazione, che potrebbero influenzare il ruolo regolatore di NO. Pertanto, in una serie di esperimenti abbiamo incubato il VSMC con SNAP in DMEM contenente 10 FBS. In questi esperimenti, attività AR è stata inibita da SNAP anche in presenza di siero, anche se cinque volte più SNAP (5 mM) è stato richiesto per inibire 60 della attività enzimatica in 6 h (dati non mostrati). Queste osservazioni suggeriscono che l'inibizione di AR da SNAP persiste in presenza di siero e non è secondaria allo stress indotto dal ritiro siero. Per accertare che l'inibizione di AR è dovuto a NO e non limitato a Snap, abbiamo studiato gli effetti di altri donatori di NO e testato se scavenging NO potrebbe abolire l'inibizione AR. Come mostrato nella Tabella 2. incubazione di VSMC con tampone KH contenente 1,0 mM ciascuno di SNAP, GSNO, GSNO-estere, NONOate o NOC-9 determinato una 6080 diminuzione dell'attività AR. Effetto di donatori di NO sui livelli di attività AR e sorbitolo in VSMC incubate con 40 mM di glucosio a esaminare le conseguenze cellulari di inibire AR, abbiamo misurato i cambiamenti nella accumulo sorbitolo. I livelli di sorbitolo di VSMC incubate in un mezzo contenente 5,5 mm di glucosio erano bassi (10 nmol / mg di proteina). Tuttavia, quando le cellule sono state incubate con 40 mM glucosio per 4 h, alte concentrazioni di sorbitolo (fino a 150 nmol / mg di proteina) sono stati accumulati. Per verificare se l'accumulo di sorbitolo in queste cellule era dovuto AR, gli effetti di due strutturalmente differenti inibitori AR sono stati studiati. Come mostrato nella Tabella 2. incubazione con tolrestat o sorbinil inibita da 95 a 97 di accumulo di sorbitolo. Questi risultati mostrano che la generazione di sorbitolo in queste cellule interamente, se non esclusivamente, a causa della riduzione AR-mediata del glucosio. Quando il VSMC sono state incubate con i donatori di NO, c'è stata una marcata diminuzione del contenuto di sorbitolo cellulare rispetto alle cellule non trattate incubate nel mezzo senza i donatori di NO. Il grado di inibizione di accumulo sorbitolo era paragonabile alla misura di inibizione dell'attività AR. N inibizione AR è stato osservato con i non-NO-contenenti analoghi di questi composti (dati non mostrati), indicando che l'inibizione era specificamente a causa del rilascio di NO. Inoltre, l'inibizione dell'attività AR da SNAP è stato impedito dal NO scavenger PTIO, conferma che l'inibizione di AR è dovuto a NO rilasciato dalla SNAP e non di effetti non specifici del donatore stesso. Così, insieme questa serie di esperimenti mostrano che inibisce NO AR in VSMC di cultura e che questa inibizione impedisce l'accumulo di sorbitolo ed è facilmente invertita sulla rimozione di NO. S-Thiolation di AR I nostri studi precedenti mostrano che l'incubazione di AR ricombinante con GSNO porta alla glutathiolation dell'enzima a Cys-298. Per esaminare se donatori di NO S-tiolato proteina AR in VSMC, queste cellule sono state preincubate con 35 S L-cisteina in presenza di cicloesimide inibitore della sintesi proteica per impedire incorporazione diretta dell'etichetta nelle proteine cellulari e generare un pool intracellulare di 35 S-etichettati GSH. Dopo marcatura metabolica, le cellule sono state incubate con 1 mM SNAP proteina AR è stato immunoprecipitato con anticorpi anti-AR e separati mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti e nonreducing. Come mostrato in Fig. 3 A, la banda proteica corrispondente Ar immunoprecipitato da cellule di SNAP-trattati è stata associata con una maggiore intensità di radioattività rispetto AR da cellule non trattate, e l'intensità della banda aumenta con l'aumentare della durata dell'esposizione. etichettatura massima della proteina è stata raggiunta in 2 h, che corrisponde in tempo per la progressiva inibizione del VSMC AR previo trattamento SNAP. Sostituzione della soluzione di incubazione con il terreno di coltura senza SNAP determinato una significativa perdita di 35 S dell'etichetta da AR in 6 ore. Inoltre, la radioattività associata con AR era considerevolmente diminuita quando la proteina è stato separato su gel riducenti contenenti - mercaptoetanolo (Fig. 3 B), dimostrando che l'etichetta è stata incorporata nella proteina tramite un legame disolfuro. Infine, per verificare la possibilità che SNAP potrebbe diminuire l'attività AR sopprimendo i livelli di proteina di AR, la stessa quantità di immunoprecipitato sono state caricate su SDS-PAGE e Western blot è stata effettuata utilizzando un anticorpo anti-AR. Non ci sono cambiamenti nei livelli di proteina AR (Fig. 3 C) suggeriscono che le differenze di radioattività associata con il gruppo AR non poteva essere rappresentato da cambiamenti nella espressione delle proteine e sono specificamente a causa di S-thiolation di AR nello snap-esposti cellule. NO-indotta S-glutathiolation di reduttasi. La piscina glutatione del VSMC nella cultura era radioattivo e le cellule sono state incubate con 1 mM SNAP 02 h. Per la rigenerazione (R) di AR, le cellule sono state lavate dopo 2 ore di incubazione di VSMC con SNAP e reincubate nei mezzi freschi per 6 ore senza SNAP. Le cellule sono state lisate a differenti intervalli e AR è stato immunoprecipitato dal lisato. Gli immunoprecipitati sono stati separati su A) nonreducing B) riducendo 10 SDS-PAGE e analizzate per autoradiografia e C) analisi Western Blot con anticorpi anti-AR, dimostrando che la stessa quantità di AR proteine ad ogni punto di tempo sono stati utilizzati. DISCUSSIONE Aldose reduttasi è un reduttasi aldo-cheto NADPH-dipendente che catalizza la riduzione di aldo-zuccheri ai polioli corrispondenti al primo e al fattore limitante della via dei polioli (17. 18). Diversi studi hanno dimostrato che la riduzione del glucosio by AR è associato con lo sviluppo di complicanze diabetiche secondarie (vedi inizio articolo) di conseguenza, l'enzima è stato ampiamente studiato come bersaglio farmacologico per il trattamento e la prevenzione delle complicanze diabetiche. Tuttavia, il comportamento fisiologico dell'enzima rimane meccanismi oscuri e cellulari che regolano l'espressione e l'attività in tessuti non diabetici e diabetici sono poco conosciute. Studi in vitro con preparazioni enzimatiche omogenee hanno dimostrato che AR è molto sensibile agli ossidanti ed è facilmente modificato da reagenti tiolo-attivo, tra donatori di NO e nitrosothiols. Questa modifica è altamente specifico perché, nonostante la presenza di tre residui di cisteina esposta al solvente, l'enzima è invariabilmente ossidato a Cys-298 situato sul sito attivo dell'enzima (13. 14). Modifica dell'enzima da donatori di NO è stata localizzata a Cys-298, che potrebbe essere stechiometricamente nitrosi o S-tiolati. La specificità e l'avidità con cui AR reagisce con i donatori di NO suggerito a noi la possibilità che NO può essere un regolatore endogena di AR e che, controllando l'attività AR, NO potrebbe regolare il metabolismo del glucosio attraverso la via dei polioli. I risultati di questo studio forniscono diverse linee di evidenza coerente con l'idea che NO è davvero un modulatore critica di via dei polioli del metabolismo del glucosio e che diminuisce l'attività di questo percorso inibendo AR. I nostri risultati suggeriscono inoltre che la perdita del regolamento n-mediata attiva AR e up-regola la sintesi poliolo. Il ruolo regolatore di NO come inibitore endogeno AR era evidente in in situ ed ex vivo così come in studi su colture cellulari. Negli esperimenti in situ con ratti non diabetici e diabetici ha mostrato che l'aumento NO generazione (fornendo l - arginina) o la disponibilità (da macchie di nitroglicerina) inibisce AR e diminuisce l'accumulo aortica di sorbitolo. Questi effetti sono stati più pronunciati nel diabete, che di per sé ha portato ad un drammatico aumento dell'attività AR e l'accumulo di sorbitolo. Questi dati indicano che stati fisiologici, patologici, o farmacologici associati con aumentato NO generazione sono suscettibili di essere invariabilmente associata ad una inibizione della sintesi poliolo nel tessuto vascolare. Viceversa, diminuzioni della sintesi di NO o disponibilità sarà up-regolare AR catalisi e aumentare il flusso di glucosio attraverso la via dei polioli. Questo punto di vista è supportata dall'osservazione che l'inibizione di NOS da L-NAME portato a quasi un duplice aumento dell'attività AR e l'accumulo di sorbitolo in entrambi i ratti diabetici e non diabetici e che la formazione sorbitolo nell'aorta dei eNOS null topo era tre volte superiore a quella in topi WT (Fig. 1). Da queste osservazioni, si deduce che NO esercita un'influenza inibitoria sull'attività AR e la via dei polioli. Il secondo messaggero NO è un gas diffusibile che regola diversi processi fisiologici, quali l'ipertensione, l'aggregazione piastrinica e la neurotrasmissione (19 20 21). Studi recenti indicano che NO regola il glucosio e il consumo di ossigeno nel cuore (22 23). Le nostre osservazioni che inibisce NO AR e sintesi sorbitolo identifica, per la prima volta, un nuovo ruolo di NO nella regolazione del metabolismo del glucosio vascolare. A differenza di cuore e il fegato, l'assorbimento di glucosio da parete dei vasi sanguigni non è regolato da insulina. Come risultato, gli stati iperglicemici come diabete mellito portano ad un aumento del glucosio nel endotelio e cellule muscolari lisce. Di conseguenza, il diabete di lunga durata è associata a complicanze vascolari multiple che sono la principale causa di morbilità e mortalità nei pazienti diabetici (24). Sebbene i meccanismi di tale danno vascolare non sono ben compresi, i nostri risultati mostrano un profondo aumento dell'attività AR e l'accumulo di sorbitolo in aorta diabetica suggeriscono che la via poliolo può essere una fonte significativa di patologia vascolare iperglicemia indotta. Come suggerito in altri tessuti, un aumento della via dei polioli potrebbe esaurire equivalenti riducenti e promuovere l'accumulo di cellule osmolyte impermeabile, sorbitolo nella parete del vaso. Insieme, questi cambiamenti potrebbero imporre ossidativo e stress osmotico (6. 7). In queste condizioni, la generazione e la disponibilità di NO potrebbero svolgere un ruolo decisivo nella prevenzione di questi cambiamenti patologici. Poiché in aorta (come nel rene, nervi o retina) l'assorbimento di glucosio non è regolato da insulina, NO può essere l'unica forma di controllo locale del metabolismo del glucosio non intrinseca agli enzimi glucosio usando stessi. indagini estese mostrano che il diabete è associato alla compromissione del rilassamento vascolare NO-mediata e una diminuzione della biodisponibilità di NO, che può essere un fattore causale in altre complicazioni e (24). La nostra osservazione che NO ermeticamente e dinamicamente controlla l'attività vascolare della via dei polioli, un mediatore chiave di lesioni iperglicemico, indica che l'attività incontrollata di questo percorso può essere una conseguenza di una ridotta critica NO durante diabete.
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